1

如何儲(chǔ)存和解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

建議血清應(yīng)保存在-2O℃。若一次無法用完一瓶，無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

將血清從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢融解，一般是融解過夜。

2

血清中包含絮狀沉淀，它們是什么，怎么處理?

沉淀主要成分是纖維蛋白和脂蛋白，不會(huì)影響血清品質(zhì)。

首先讓其沉淀在瓶子底部，中上層無沉淀血清直接轉(zhuǎn)出使用，下層血清裝到50ml無菌離心管，400g，離心3分鐘即可除去 (一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因?yàn)槌恋頃?huì)堵塞濾膜而無法過濾)。

3

實(shí)驗(yàn)室如何選擇適合的血清?

稀有的澳洲血清培養(yǎng)嬌貴細(xì)胞(小鼠ES、原代細(xì)胞分離培養(yǎng))，南美血清或國產(chǎn)胎牛血清用于癌細(xì)胞、常規(guī)細(xì)胞系培養(yǎng)(用量最大)，新生牛血清用于病毒包裝(構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)。

4

微生物培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

5

有必要做熱滅活嗎?

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量!

6

細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理?

一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，首先，要肉眼觀察微生物培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，微生物培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：

(1)細(xì)胞生長過老，破碎的細(xì)胞殘骸;

(2)血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長; 

(4)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

7

EDTA在細(xì)胞消化過程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而細(xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的，把這些離子螯合后，可以加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離，促進(jìn)消化。上皮類細(xì)胞的連接存在“橋粒”結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞間最“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細(xì)胞時(shí)，加入EDTA，可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞。通俗地說，就是破壞細(xì)胞間的粘連。 

8

如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。首選DMEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。另外還可以參考ATCC網(wǎng)站的推薦信息。 

9

怎樣讓細(xì)胞適應(yīng)新的條件?

從原條件逐漸過度：1/4、1/2、3/4，最后是完全新培養(yǎng)基。

10

為何微生物培養(yǎng)基保存于4℃，顏色會(huì)偏暗紅色?

1.培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成微生物培養(yǎng)基越來越偏堿性。顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。 

2.培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。需調(diào)整pH值至~7.2. 

11

細(xì)胞凍存管應(yīng)如何解凍?

37℃，1~2分鐘內(nèi)全部融解。

冷凍管建議放在液氮液面上面，由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全(戴護(hù)目鏡)，預(yù)防冷凍管之爆裂。 

12

細(xì)胞凍存管應(yīng)如何解凍?

可能原因：

(1)胰蛋白酶消化過度 

(2)支原體污染 

(3)消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng) 

(4)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性) 

(5)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 

解決辦法： 

(1)縮短消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度 

(2)如發(fā)現(xiàn)支原體污染，及時(shí)丟棄培養(yǎng)物。 

(3)重新配置消化液或培養(yǎng)液 

(4)復(fù)蘇新的保種細(xì)胞 

(5)調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度