免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）是組織化學(xué)的一種，它是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等，顯示一定的顏色，并借助顯微鏡觀察其顏色的變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成份或化學(xué)性質(zhì)。免疫組化標(biāo)記具有形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對(duì)免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷，現(xiàn)擇要分述如下：

 

一陽(yáng)性標(biāo)記色度特征

免疫組化標(biāo)記時(shí)細(xì)胞陽(yáng)性著色程度取決于抗原含量、分布密度和標(biāo)記方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，標(biāo)記方法越敏感，陽(yáng)性結(jié)果顯色則越強(qiáng)。根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)記的顯色程度分為：淡黃色，提示為弱陽(yáng)性；棕黃色，為中等度陽(yáng)性；棕黑色，示為強(qiáng)陽(yáng)性。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判斷依據(jù)。而前者除考慮標(biāo)本處理和方法學(xué)因素外，可能與細(xì)胞只有輕度異常表達(dá)，或某些細(xì)胞攝取了周圍組織抗原之故。

二陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征

免疫組化標(biāo)記中，陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征是反映抗原在細(xì)胞中的定位和分布情況。在診斷中陽(yáng)性細(xì)胞以擬標(biāo)記的細(xì)胞為前提，陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的陽(yáng)性表達(dá)和非目標(biāo)細(xì)胞即使陽(yáng)性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。根據(jù)抗原在細(xì)胞中分布和陽(yáng)性顆粒沉淀部位可分為以下5種類型：

1.胞膜型  陽(yáng)性顆粒主要分布于細(xì)胞膜表面，形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個(gè)細(xì)胞。此類型常見于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白細(xì)胞共同抗原（LCA）及B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞相關(guān)抗原（GAA）和Ki-1等。

2.胞核型  陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞核，呈均勻分布或位于核膜下，有的呈小斑塊狀不規(guī)則分布。此多見于增殖細(xì)胞核抗原、Ki-67及激素受體中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和基因p53等。

3.胞漿型  陽(yáng)性顆粒主要分布于細(xì)胞漿。大部分抗原均屬于此種類型，如細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、結(jié)蛋白、神經(jīng)絲蛋白、肌紅蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特異性抗原（PSA）等。依據(jù)抗原在胞漿內(nèi)分布形式，通常表現(xiàn)為彌漫性分布或局限性分布。前者陽(yáng)性顆粒彌漫而均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞漿。局限性是指陽(yáng)性顆粒呈小斑點(diǎn)狀或斑塊狀局限于細(xì)胞漿中的某一部位、核周或細(xì)胞漿的一側(cè)。

4.微絨毛型  抗原顆粒主要分布于腺癌細(xì)胞的微絨毛，而胞漿和胞膜可以是陽(yáng)性或陰性表達(dá)。這種表現(xiàn)形式最常見于各種腺癌，如甲狀腺癌、乳腺癌、胃腸腺癌、膽道腺癌、等。其特點(diǎn)是陽(yáng)性顆粒除靠近腔面陽(yáng)性外，其余基底部可呈陰性反應(yīng)。

5.復(fù)合型  在常規(guī)免疫組化標(biāo)記中，同一種抗原可以同時(shí)表達(dá)于胞膜和胞漿、胞核和胞漿，但很少發(fā)現(xiàn)胞膜和胞核同時(shí)表達(dá)。值得注意的是組織標(biāo)本固定不及時(shí)造成抗原移位使胞核和胞漿同時(shí)陽(yáng)性。

三非特異著色特征

以下情況可干擾免疫組化標(biāo)記結(jié)果的觀察和判斷：

（1）抗體交叉反應(yīng)：  是由于該抗原決定簇同時(shí)存在于多種組織細(xì)胞，如GFAP可同時(shí)存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白則更為嚴(yán)重，可表達(dá)于多種組織細(xì)胞。因此，應(yīng)全面了解和認(rèn)識(shí)該抗體的功能和標(biāo)記范圍。故抗體交叉反應(yīng)只要應(yīng)用得當(dāng)仍有助于診斷。

（2）非特異性染色  是指抗原無明確定位，腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)均為黃色，相互累及一片，色度無深淺之分。這種標(biāo)記組織片不能作為免疫組織標(biāo)記結(jié)果判斷依據(jù)。

非特異性染色的原因常為組織標(biāo)本固定不佳、抗體質(zhì)量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，如前所述，陽(yáng)性顆粒應(yīng)位于細(xì)胞胞膜、胞漿或胞核，陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜，陽(yáng)性染色強(qiáng)度深淺不一。如果缺乏細(xì)胞間的不均一性染色，即是呈陽(yáng)性染色，常提示為非特異性染色。

免疫組化結(jié)果的判斷原則及對(duì)假陰性和假陽(yáng)性的認(rèn)識(shí)

一免疫組化結(jié)果的判斷原則

免疫組化具有特異性強(qiáng)、敏感性高及定位正確等優(yōu)點(diǎn)，但隨著免疫組化應(yīng)用的普及和深入，越來越多的問題也隨之出現(xiàn)。因此，掌握對(duì)免疫組化結(jié)果的判斷原則是很重要的。

必須設(shè)染色對(duì)照  每批染色都要以特異性的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照為基礎(chǔ)，才能對(duì)染色結(jié)果做出正確的判斷。沒有陽(yáng)性對(duì)照，就不能做出真正陰性結(jié)果的判斷；同理，沒有陰性對(duì)照，也就不能做出真正陽(yáng)性結(jié)果的判斷。因而，沒有對(duì)照的免疫組化染色，即使做出了判斷也是不可信的。

抗原表達(dá)必須在特定部位  陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽(yáng)性，如LCA在細(xì)胞膜上、Keratin在細(xì)胞漿內(nèi)、S-100蛋白在胞漿和胞核內(nèi)，EMA在細(xì)胞膜上。不在抗原所在部位的陽(yáng)性表達(dá)一概不能視為陽(yáng)性。

陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)  即陰性結(jié)果不能認(rèn)為具有否定意義；陽(yáng)性表達(dá)有強(qiáng)弱、多少之分，哪怕是只是有少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性（但要在抗原所在部位）也要視為陽(yáng)性表達(dá)，不能認(rèn)為個(gè)別細(xì)胞陽(yáng)性而不作陽(yáng)性看待。

免疫組化與HE切片診斷應(yīng)以HE切片診斷為準(zhǔn)  當(dāng)免疫組化診斷結(jié)果與HE切片診斷不一致時(shí)，應(yīng)再結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果綜合分析，不能用免疫組化檢查結(jié)果推翻HE切片診斷。

抗原表達(dá)必須在特定部位

陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞核組織特定的抗原部位才能視為陽(yáng)性，比如角蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）在細(xì)胞核內(nèi)，上皮細(xì)胞膜抗原（EMA）和白細(xì)胞共同抗原（LCA）在細(xì)胞膜上。

盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)

由于內(nèi)源性酶的干擾和出血壞死區(qū)呈現(xiàn)的彌漫性成片著色屬于非抗原定位反應(yīng)，判斷時(shí)，應(yīng)加以除外，切痕和組織周邊界面也常常呈現(xiàn)非特異性陽(yáng)性著色，這是由于界面不平整，標(biāo)記試劑殘留干擾所致，也非真實(shí)抗原陽(yáng)性標(biāo)記。

對(duì)照片的設(shè)置

免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，沒有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。對(duì)照包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和自身對(duì)照。在實(shí)踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對(duì)照，而用含抗原的正常組織作陽(yáng)性對(duì)照，這種自我對(duì)照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果時(shí)，先觀察對(duì)照組織的結(jié)果，如陽(yáng)性對(duì)照組織中陽(yáng)性細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照細(xì)胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無非特異性染色時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)的全部試劑和全過程技術(shù)操作準(zhǔn)確無誤，待檢組織中的陽(yáng)性細(xì)胞也就是可信的正確結(jié)果。

免疫組化染色中對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下：

1) 空白對(duì)照(陰性對(duì)照)：第一抗體由 PBS 或非免疫血清取代。

2) 陽(yáng)性對(duì)照：用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽(yáng)性對(duì)照，是實(shí)驗(yàn)室比較常用的對(duì)照。

3) 回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照：已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。

4) 替代對(duì)照：用于第一抗體同種動(dòng)物的血清或無關(guān)抗體代替第一抗體，結(jié)果為陰性。

5) 自身對(duì)照：在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽(yáng)性或陰性結(jié)果與檢測(cè)目的物對(duì)照比較。如 actin、CD34 在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽(yáng)性，vimentin 可以間質(zhì)細(xì)胞對(duì)照，desmin 以血管壁及肌束為對(duì)照，S-l00 蛋白以小神經(jīng)末梢為對(duì)照等；如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。

二引起假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的原因

1.假陰性結(jié)果的原因主要是：

（1）抗體已失活或濃度不當(dāng)或抗體本身達(dá)不到應(yīng)有的敏感度；

（2）由于組織自溶，抗原擴(kuò)散而導(dǎo)致抗原消失，特別在長(zhǎng)期固定的標(biāo)本中因抗原漏出而致假陰性，因此應(yīng)多用新鮮固定之標(biāo)本；

（3）操作步驟不當(dāng)，如反應(yīng)時(shí)間不夠或過久、洗脫不夠或溫度過高；

（4）組織或細(xì)胞中抗原的含量很低，所用的方法難以檢測(cè)到，如用直接法檢測(cè)為陰性，但改用間接法時(shí)則為陽(yáng)性。

2.假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因是：

（1）所用的抗體與其它無關(guān)的抗原有交叉反應(yīng)，特異性差，特別在應(yīng)用多克隆抗血清時(shí)更易出現(xiàn)；

（2）所用抗體濃度過高或染色過程中切片干燥導(dǎo)致抗體與組織產(chǎn)生非特異性結(jié)合；

（3）組織或細(xì)胞中有內(nèi)源性過氧化物酶、堿性磷酸酶及生物素等產(chǎn)生非特異性顯色。