艾滋病病毒( HIV) 即人類免疫缺陷病毒, 主要侵襲人體免疫系統(tǒng), 導(dǎo)致人體發(fā)生多種疾病。HIV 感染的診斷是艾滋病預(yù)防控制工作的重要組成部分, 只有發(fā)現(xiàn)傳染源才能更有效地控制艾滋病傳播。要確定是否感染HIV, 只有通過(guò)檢測(cè)HIV 的特異性抗體、抗原、核酸或病毒分離培養(yǎng)等, 而目前血清學(xué)實(shí)驗(yàn)仍然是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HIV 的主要方法, 但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展, HIV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法取得了很大進(jìn)展。為此, 本文對(duì)HIV 抗體、抗原檢測(cè)方法、核酸檢測(cè)及免疫功能檢測(cè)方法等的進(jìn)展作一綜述。
1、常規(guī)HIV 抗體檢測(cè)的方法
HIV 抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)( 包括初篩和復(fù)檢) 和確證試驗(yàn) 。
1.1 篩查試驗(yàn)
1.1.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) 適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè), 目前是各級(jí)疾控機(jī)構(gòu)及大、中、小型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室篩查HIV 抗體的主要技術(shù)手段?？墒褂醚?、唾液、尿液樣品。ELISA 的基本原理是將待測(cè)抗原或抗體先固定于固相載體表面, 再用酶標(biāo)記的抗原或抗體與已被固定的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng), 加底物顯色, 用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。此方法是最常用的篩查方法, 目前國(guó)內(nèi)外主要使用第三代( 雙抗原夾心法) 試劑, 幾乎不用第二代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主, 國(guó)際上有些國(guó)家和地區(qū)已將第四代ELISA 試劑用于血源篩查。第四代ELISA 試劑可同時(shí)檢測(cè)P24 抗原和HIV - 1 /2抗體。與第三代HIV - 1 /2 抗體試劑相比, 檢出時(shí)間提前了4~ 9d。其優(yōu)點(diǎn)在于可同時(shí)檢測(cè)抗原和抗體, 降低血源篩查的殘余危險(xiǎn)度。
1.1.2化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn) 這類試劑采用發(fā)光或熒光底物, 既可檢測(cè)抗體, 也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體。HIV 抗原或抗體包被于固相載體, 加入待檢樣品和酶或熒光標(biāo)記的HIV 抗原或抗體, 加發(fā)光或熒光底物, 用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定。
1.1.3快速檢測(cè)( RT) 及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速,適用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診檢測(cè)。一般可在10 ~ 30min 內(nèi)得出結(jié)果。
1.1.3.1明膠顆粒凝集試驗(yàn)( PA) 是HIV 血清抗體檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法。將HIV 抗原致敏明膠顆粒作為載體, 與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV 抗體時(shí), 明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng), 根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA 試劑有2 種: 同時(shí)檢測(cè)HIV - 1 和HIV - 2 抗體以及分別檢測(cè)HIV - 1 和HIV - 2 抗體。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定。
1.1.3.2免疫滲濾試驗(yàn) 斑點(diǎn)ELISA 和斑點(diǎn)免疫膠體金( 或膠體硒) 快速試驗(yàn), 均以硝酸纖維膜為載體, HIV 抗原點(diǎn)狀固定在膜上, 加待檢樣品。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10min 以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。
1.1.3.3免疫層析試驗(yàn) 以硝酸纖維膜為載體, HIV 抗原線狀固定在膜上, 待檢樣品( 血液或唾液) 沿著固相載體遷移,陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色。免疫層析試驗(yàn)還可在固相載體的不同部位包被不同的抗原來(lái)檢測(cè)HIV - 1 M 亞型及O 亞型 。雖然免疫層析試驗(yàn)靈敏度不及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。但由于該法具有試劑無(wú)需冷藏、步驟簡(jiǎn)捷、無(wú)需任何儀器設(shè)備及容易解釋結(jié)果等特點(diǎn),適合于基層實(shí)驗(yàn)室篩查使用。
1.2HIV 抗體確證方法
包括免疫印跡試驗(yàn)( WB) 、條帶免疫試驗(yàn)、放射免疫沉淀試驗(yàn)( RIPA) 及免疫熒光試驗(yàn)( IFA) 等。
1.2.1免疫印跡試驗(yàn)( WB) 目前國(guó)內(nèi)最常用的診斷HIV感染的確認(rèn)檢測(cè)方法, 也是《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范( 2009 版) 》中的首選確認(rèn)方法, 其敏感性和特異性均很高,用來(lái)對(duì)篩查試驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行鑒定。其基本原理是將提純的HIV 顆粒裂解為不同的組分, 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳, 病毒的不同蛋白在電泳中按分子大小排列開, 在電場(chǎng)力作用下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上, 再與特異性抗體孵育, 洗去游離抗體,然后和酶標(biāo)記的二抗孵育, 再進(jìn)行底物顯色, 根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。WB 雖作為HIV抗體確認(rèn)的首選方法, 但依然有一定的局限性, 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),操作不當(dāng)和誤判帶型的假陽(yáng)性率> 2%。另有文獻(xiàn)報(bào)道4%~ 20%的樣品經(jīng)過(guò)HIV 初篩復(fù)檢陽(yáng)性后, WB 結(jié)果為“ 不確定”。相當(dāng)數(shù)量的“不確定”樣品與P24 條帶有關(guān)。一種可能的解釋是與非特異性抗體有關(guān) 。
1.2.2條帶免疫試驗(yàn) 條帶免疫試驗(yàn)的原理和操作方法與免疫印跡試驗(yàn)十分相似, 區(qū)別僅在于條帶免疫試驗(yàn)條膜上的抗原是重組或化學(xué)合成的多肽的抗原, 而且是人工固定在條膜上的。
1.2.3免疫熒光試驗(yàn)( IFA) 將HIV 感染的淋巴細(xì)胞固定在玻片上作為抗原, 與待檢血清反應(yīng)后加入熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白, 洗去未結(jié)合的熒光抗體, 在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果, 如陽(yáng)性標(biāo)本會(huì)在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性熒光。IFA 法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速, 曾被FDA 推薦用于WB 不確定樣品的診斷。但需要昂貴的熒光顯微鏡, 觀察和解釋結(jié)果易受主觀因素影響,結(jié)果不宜長(zhǎng)期保存, 不宜在一般的實(shí)驗(yàn)室開展和應(yīng)用。
1.2.4放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)( RIPA) 將放射性同位素標(biāo)記的氨基酸加到感染HIV 的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 隨著病毒的復(fù)制,這些標(biāo)記的氨基酸就進(jìn)入病毒的蛋白中, 收集含有同位素的病毒顆粒, 用去垢劑將細(xì)胞溶解, 再用抗IgG A 蛋白瓊脂糖去除有反應(yīng)性的細(xì)胞抗原。將所得的上清液( 含有病毒蛋白) 與待檢血清混合, 如有HIV 抗體, 則同位素標(biāo)記的HIV 抗原與之結(jié)合形成沉淀。用SDS - PAGE 電泳將沉淀物中的病毒蛋白按照分子量大小分離開來(lái), 并與已知的分子量標(biāo)準(zhǔn)比較。用這個(gè)方法可檢測(cè)HIV - 1 的160、120、66、51 ~ 55、41、31、24和17kD 的蛋白抗體。這是目前最具敏感性和特異性的HIV 抗體檢測(cè)方法, 但這種方法費(fèi)時(shí)多、技術(shù)難度大, 且需使用同位素, 一般僅用于研究而非實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用。
2、HIV 抗原檢測(cè)
檢測(cè)HIV - 1 抗原指的是檢測(cè)HIV 的核心抗原P24。HIV侵入機(jī)體后, 核心抗原P24 的水平隨著病毒RNA 水平的發(fā)展而發(fā)展, 并在急性感染期出現(xiàn), 通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志, 與病情發(fā)展密切相關(guān)。因此, 血液及其它體液標(biāo)本中P24 抗原的檢測(cè)可縮短窗口期, 有助于HIV 的早期診斷、預(yù)后判斷及評(píng)價(jià)抗病毒治療的效果, 具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前HIV P24 抗原檢測(cè)一般用抗體夾心ELISA 法, 有定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。定性檢測(cè)又包括篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn), HIV - 1 P24抗原篩選試驗(yàn)有反應(yīng)的標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)確證以才能判斷陽(yáng)性或陰性。其結(jié)果陽(yáng)性僅作為HIV 感染的輔助診斷依據(jù),不能據(jù)此確診, 而陰性結(jié)果也不能排除HIV 感染。此法簡(jiǎn)便易行, 但靈敏度較差, 50% ~ 80%。由于ELISA 本身的局限性以及P24 抗原檢測(cè)在HIV - 1 診斷中的重要作用, 近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)建立高靈敏度檢測(cè)P24 抗原的研究一直未曾停止。先后研發(fā)了免疫復(fù)合物解離P24 抗原測(cè)定法( immune complex dis associate, ICD) , 信號(hào)放大增強(qiáng)ELISA ( signal amplification boosted ELISA) , 線性免疫酶測(cè)定( linealimmunoenzymatic as say , LIA) 超敏感酶免測(cè)定法( ultrasensitive enzyme immunoas say , UEI) , 免疫吸附電鏡法( immunosorbent electron micro scopical method, ISEM) 和納米粒子生物條形碼檢測(cè)技術(shù)( nanoparticle based biobarcode amplification assay , BCA) 等。有研究表明, ICD 的敏感性已提高到90% , 而LIA 最敏感的抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)閾值為0.01pg /mL 。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展, 這些新技術(shù)將有很好的應(yīng)用前景。
3、HIV 核酸檢測(cè)
HIV 核酸檢測(cè)有定性和定量2 類, 定性檢測(cè)通常使用PCR或RT - PCR 技術(shù), 一般使用擴(kuò)增HIV gag 和/或pol 和/或env和/ 或LTR 等引物。進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄時(shí)可使用下游特異性引物或隨機(jī)引物。引物設(shè)計(jì)可參考文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì), 應(yīng)盡量涵蓋常見的HIV 流行毒株, 也可使用兼并性引物。HIV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性, 可作為診斷HIV 感染的輔助指標(biāo), 不單獨(dú)用于HIV 感染的診斷; HIV 核酸檢測(cè)陰性, 只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性,不可排除HIV 感染。定量檢測(cè)通常是HIV 病毒載量檢測(cè), 常用于監(jiān)測(cè)HIV 感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。目前常用的HIV RNA 定量測(cè)定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR 實(shí)驗(yàn)( RT - PCR) 、核酸序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)( NASBA) 、分支DNA 雜交實(shí)驗(yàn)( bDNA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 核酸檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視, 這就促進(jìn)了應(yīng)用PCR 技術(shù)進(jìn)行HIV 核酸檢測(cè)的快速發(fā)展, 通過(guò)這種技術(shù), 不但可進(jìn)行定性檢測(cè), 還可進(jìn)行定量檢測(cè)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等許多優(yōu)點(diǎn), 但由于所需的試劑、儀器昂貴, 費(fèi)用高, 難以承擔(dān),欲將該技術(shù)真正運(yùn)用到常規(guī)檢驗(yàn)工作中存在相當(dāng)難度。
4、HIV 耐藥檢測(cè)
HIV 耐藥檢測(cè)的方法可分為基因型和表型2 大類檢測(cè)法。HIV 耐藥基因型檢測(cè)法基于對(duì)耐藥相關(guān)基因突變的檢測(cè), 利用耐藥基因型解釋系統(tǒng)判斷是否耐藥以及耐藥程度; HIV 耐藥表型檢測(cè)法基于體外培養(yǎng)技術(shù), 通過(guò)檢測(cè)抑制病毒生長(zhǎng)所需的藥物濃度( IC50 或IC90) , 并與參考株進(jìn)行比較, 判斷病毒對(duì)藥物的敏感程度。常用的HIV 耐藥檢測(cè)方法為基因型檢測(cè)法,通常使用逆轉(zhuǎn)錄PCR ( RT - PCR) 和測(cè)序方法。HIV 耐藥檢測(cè)用于HIV 感染人群和抗病毒治療人群的耐藥性監(jiān)測(cè)和檢測(cè)及個(gè)體患者的耐藥檢測(cè)。
5、CD4 + 和CD8 + T 淋巴細(xì)胞檢測(cè)
CD4 + 和CD8 + T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法分為2 大類, 一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定法, 另一類是非流式細(xì)胞儀測(cè)定法。常用的方法為流式細(xì)胞儀。通過(guò)CD4 + T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可評(píng)價(jià)HIV 感染者免疫狀況, 輔助臨床進(jìn)行疾病分期; 可作為兒童免疫抑制分級(jí)指標(biāo)及臨床治療分期和輔助條件; 可評(píng)估疾病進(jìn)展和HIV 感染者機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn); 可判斷預(yù)后狀況和輔助判斷是否進(jìn)行預(yù)防性治療; 可作為是否開始抗病毒治療和判斷免疫系統(tǒng)恢復(fù)情況的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之一。CD8 + T 淋巴細(xì)胞為抑制性/ 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞, HIV 感染者CD8 + T 細(xì)胞數(shù)量增加,導(dǎo)致CD4 /CD8 比值下降, 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo), CD4T 淋巴細(xì)胞/ CD8T淋巴細(xì)胞比值通常為2, 若該值小于1 則提示細(xì)胞免疫狀況不佳, 比值越低說(shuō)明免疫缺陷越嚴(yán)重。
6、HIV 的分離培養(yǎng)
一般采用靶細(xì)胞( HIV 陰性者外周血淋巴細(xì)胞, PBMC)與受檢者標(biāo)本( PBMC、全血、血漿、精液及其他體液) 共培養(yǎng)的方法, 最常用的方法是PBMC 共培養(yǎng)。樣本首選新鮮抗凝全血, 也可使用血漿、精液及其他體液, HIV 分離培養(yǎng)陽(yáng)性可確證為HIV 感染, 分離培養(yǎng)陰性不能排除HIV 感染。HIV 的分離培養(yǎng)可作為HIV 抗體不確定或HIV 陽(yáng)性母親所生嬰兒的鑒別診斷; 可用于HIV 表型耐藥檢測(cè)及其他HIV 生物學(xué)特征的研究; 還用于HIV 感染的輔助診斷。
7、HIV - 1 新近感染檢測(cè)
HIV 常規(guī)抗體檢測(cè)方法可判定感染和未感染狀態(tài), 新近感染檢測(cè)方法則用于識(shí)別近期感染與既往感染。目前, 檢測(cè)HIV新近感染的血清學(xué)方法中, 研究和應(yīng)用最多的是BED - EIA HIV - 1 捕獲EIA 方法( BED - CEIA) , 其原理是根據(jù)HIV 特異性IgG 占總IgG 抗體的比例隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高。應(yīng)用BED - CEIA 進(jìn)行新近感染檢測(cè)只適用于HIV 陽(yáng)性樣品。由于個(gè)體間抗體生成的變異性, 對(duì)個(gè)體而言, BED 結(jié)果的預(yù)測(cè)值偏低, 而且在個(gè)體水平上BED 檢測(cè)可能產(chǎn)生一定的假陽(yáng)性和假陰性, 但在人群水平上, 假陽(yáng)性的數(shù)目與假陰性的數(shù)目相近, 因此可相互抵消彼此的作用。美國(guó)FDA 將BED -CEIA 歸為“只應(yīng)用于監(jiān)測(cè)目的, 不能用于個(gè)體診斷和臨床”的實(shí)驗(yàn)方法。
以上介紹了艾滋病病毒各種檢測(cè)方法, 不同的方法有其優(yōu)缺點(diǎn), 臨床應(yīng)用也各異?？傊? 隨著感染者不斷增加、感染人群的變化和臨床病人的日益增多, 艾滋病檢測(cè)工作量逐漸加大, 新的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)需求也不斷增加, 這就要求廣大科研工作者在今后的工作中要有創(chuàng)新精神, 不斷探索, 研究開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑, 使其既能滿足艾滋病檢測(cè)工作的實(shí)際需要, 又能體現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展, 縮短檢測(cè)的窗口期, 避免漏檢, 以更有效地遏制艾滋病的蔓延, 保護(hù)廣大人民群眾的身體健康。
1、常規(guī)HIV 抗體檢測(cè)的方法
HIV 抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)( 包括初篩和復(fù)檢) 和確證試驗(yàn) 。
1.1 篩查試驗(yàn)
1.1.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) 適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè), 目前是各級(jí)疾控機(jī)構(gòu)及大、中、小型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室篩查HIV 抗體的主要技術(shù)手段?？墒褂醚?、唾液、尿液樣品。ELISA 的基本原理是將待測(cè)抗原或抗體先固定于固相載體表面, 再用酶標(biāo)記的抗原或抗體與已被固定的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng), 加底物顯色, 用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。此方法是最常用的篩查方法, 目前國(guó)內(nèi)外主要使用第三代( 雙抗原夾心法) 試劑, 幾乎不用第二代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主, 國(guó)際上有些國(guó)家和地區(qū)已將第四代ELISA 試劑用于血源篩查。第四代ELISA 試劑可同時(shí)檢測(cè)P24 抗原和HIV - 1 /2抗體。與第三代HIV - 1 /2 抗體試劑相比, 檢出時(shí)間提前了4~ 9d。其優(yōu)點(diǎn)在于可同時(shí)檢測(cè)抗原和抗體, 降低血源篩查的殘余危險(xiǎn)度。
1.1.2化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn) 這類試劑采用發(fā)光或熒光底物, 既可檢測(cè)抗體, 也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體。HIV 抗原或抗體包被于固相載體, 加入待檢樣品和酶或熒光標(biāo)記的HIV 抗原或抗體, 加發(fā)光或熒光底物, 用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定。
1.1.3快速檢測(cè)( RT) 及其它檢測(cè)試驗(yàn)這類試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速,適用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診檢測(cè)。一般可在10 ~ 30min 內(nèi)得出結(jié)果。
1.1.3.1明膠顆粒凝集試驗(yàn)( PA) 是HIV 血清抗體檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法。將HIV 抗原致敏明膠顆粒作為載體, 與待檢樣品作用。當(dāng)待檢樣品含有HIV 抗體時(shí), 明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應(yīng), 根據(jù)凝集情況判讀結(jié)果。PA 試劑有2 種: 同時(shí)檢測(cè)HIV - 1 和HIV - 2 抗體以及分別檢測(cè)HIV - 1 和HIV - 2 抗體。有效試驗(yàn)的陰性和陽(yáng)性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定。
1.1.3.2免疫滲濾試驗(yàn) 斑點(diǎn)ELISA 和斑點(diǎn)免疫膠體金( 或膠體硒) 快速試驗(yàn), 均以硝酸纖維膜為載體, HIV 抗原點(diǎn)狀固定在膜上, 加待檢樣品。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10min 以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。
1.1.3.3免疫層析試驗(yàn) 以硝酸纖維膜為載體, HIV 抗原線狀固定在膜上, 待檢樣品( 血液或唾液) 沿著固相載體遷移,陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色。免疫層析試驗(yàn)還可在固相載體的不同部位包被不同的抗原來(lái)檢測(cè)HIV - 1 M 亞型及O 亞型 。雖然免疫層析試驗(yàn)靈敏度不及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。但由于該法具有試劑無(wú)需冷藏、步驟簡(jiǎn)捷、無(wú)需任何儀器設(shè)備及容易解釋結(jié)果等特點(diǎn),適合于基層實(shí)驗(yàn)室篩查使用。
1.2HIV 抗體確證方法
包括免疫印跡試驗(yàn)( WB) 、條帶免疫試驗(yàn)、放射免疫沉淀試驗(yàn)( RIPA) 及免疫熒光試驗(yàn)( IFA) 等。
1.2.1免疫印跡試驗(yàn)( WB) 目前國(guó)內(nèi)最常用的診斷HIV感染的確認(rèn)檢測(cè)方法, 也是《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范( 2009 版) 》中的首選確認(rèn)方法, 其敏感性和特異性均很高,用來(lái)對(duì)篩查試驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行鑒定。其基本原理是將提純的HIV 顆粒裂解為不同的組分, 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳, 病毒的不同蛋白在電泳中按分子大小排列開, 在電場(chǎng)力作用下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上, 再與特異性抗體孵育, 洗去游離抗體,然后和酶標(biāo)記的二抗孵育, 再進(jìn)行底物顯色, 根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。WB 雖作為HIV抗體確認(rèn)的首選方法, 但依然有一定的局限性, 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),操作不當(dāng)和誤判帶型的假陽(yáng)性率> 2%。另有文獻(xiàn)報(bào)道4%~ 20%的樣品經(jīng)過(guò)HIV 初篩復(fù)檢陽(yáng)性后, WB 結(jié)果為“ 不確定”。相當(dāng)數(shù)量的“不確定”樣品與P24 條帶有關(guān)。一種可能的解釋是與非特異性抗體有關(guān) 。
1.2.2條帶免疫試驗(yàn) 條帶免疫試驗(yàn)的原理和操作方法與免疫印跡試驗(yàn)十分相似, 區(qū)別僅在于條帶免疫試驗(yàn)條膜上的抗原是重組或化學(xué)合成的多肽的抗原, 而且是人工固定在條膜上的。
1.2.3免疫熒光試驗(yàn)( IFA) 將HIV 感染的淋巴細(xì)胞固定在玻片上作為抗原, 與待檢血清反應(yīng)后加入熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白, 洗去未結(jié)合的熒光抗體, 在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果, 如陽(yáng)性標(biāo)本會(huì)在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性熒光。IFA 法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速, 曾被FDA 推薦用于WB 不確定樣品的診斷。但需要昂貴的熒光顯微鏡, 觀察和解釋結(jié)果易受主觀因素影響,結(jié)果不宜長(zhǎng)期保存, 不宜在一般的實(shí)驗(yàn)室開展和應(yīng)用。
1.2.4放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)( RIPA) 將放射性同位素標(biāo)記的氨基酸加到感染HIV 的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 隨著病毒的復(fù)制,這些標(biāo)記的氨基酸就進(jìn)入病毒的蛋白中, 收集含有同位素的病毒顆粒, 用去垢劑將細(xì)胞溶解, 再用抗IgG A 蛋白瓊脂糖去除有反應(yīng)性的細(xì)胞抗原。將所得的上清液( 含有病毒蛋白) 與待檢血清混合, 如有HIV 抗體, 則同位素標(biāo)記的HIV 抗原與之結(jié)合形成沉淀。用SDS - PAGE 電泳將沉淀物中的病毒蛋白按照分子量大小分離開來(lái), 并與已知的分子量標(biāo)準(zhǔn)比較。用這個(gè)方法可檢測(cè)HIV - 1 的160、120、66、51 ~ 55、41、31、24和17kD 的蛋白抗體。這是目前最具敏感性和特異性的HIV 抗體檢測(cè)方法, 但這種方法費(fèi)時(shí)多、技術(shù)難度大, 且需使用同位素, 一般僅用于研究而非實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用。
2、HIV 抗原檢測(cè)
檢測(cè)HIV - 1 抗原指的是檢測(cè)HIV 的核心抗原P24。HIV侵入機(jī)體后, 核心抗原P24 的水平隨著病毒RNA 水平的發(fā)展而發(fā)展, 并在急性感染期出現(xiàn), 通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志, 與病情發(fā)展密切相關(guān)。因此, 血液及其它體液標(biāo)本中P24 抗原的檢測(cè)可縮短窗口期, 有助于HIV 的早期診斷、預(yù)后判斷及評(píng)價(jià)抗病毒治療的效果, 具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前HIV P24 抗原檢測(cè)一般用抗體夾心ELISA 法, 有定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。定性檢測(cè)又包括篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn), HIV - 1 P24抗原篩選試驗(yàn)有反應(yīng)的標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)確證以才能判斷陽(yáng)性或陰性。其結(jié)果陽(yáng)性僅作為HIV 感染的輔助診斷依據(jù),不能據(jù)此確診, 而陰性結(jié)果也不能排除HIV 感染。此法簡(jiǎn)便易行, 但靈敏度較差, 50% ~ 80%。由于ELISA 本身的局限性以及P24 抗原檢測(cè)在HIV - 1 診斷中的重要作用, 近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)建立高靈敏度檢測(cè)P24 抗原的研究一直未曾停止。先后研發(fā)了免疫復(fù)合物解離P24 抗原測(cè)定法( immune complex dis associate, ICD) , 信號(hào)放大增強(qiáng)ELISA ( signal amplification boosted ELISA) , 線性免疫酶測(cè)定( linealimmunoenzymatic as say , LIA) 超敏感酶免測(cè)定法( ultrasensitive enzyme immunoas say , UEI) , 免疫吸附電鏡法( immunosorbent electron micro scopical method, ISEM) 和納米粒子生物條形碼檢測(cè)技術(shù)( nanoparticle based biobarcode amplification assay , BCA) 等。有研究表明, ICD 的敏感性已提高到90% , 而LIA 最敏感的抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)閾值為0.01pg /mL 。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展, 這些新技術(shù)將有很好的應(yīng)用前景。
3、HIV 核酸檢測(cè)
HIV 核酸檢測(cè)有定性和定量2 類, 定性檢測(cè)通常使用PCR或RT - PCR 技術(shù), 一般使用擴(kuò)增HIV gag 和/或pol 和/或env和/ 或LTR 等引物。進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄時(shí)可使用下游特異性引物或隨機(jī)引物。引物設(shè)計(jì)可參考文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì), 應(yīng)盡量涵蓋常見的HIV 流行毒株, 也可使用兼并性引物。HIV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性, 可作為診斷HIV 感染的輔助指標(biāo), 不單獨(dú)用于HIV 感染的診斷; HIV 核酸檢測(cè)陰性, 只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性,不可排除HIV 感染。定量檢測(cè)通常是HIV 病毒載量檢測(cè), 常用于監(jiān)測(cè)HIV 感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。目前常用的HIV RNA 定量測(cè)定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR 實(shí)驗(yàn)( RT - PCR) 、核酸序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)( NASBA) 、分支DNA 雜交實(shí)驗(yàn)( bDNA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 核酸檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視, 這就促進(jìn)了應(yīng)用PCR 技術(shù)進(jìn)行HIV 核酸檢測(cè)的快速發(fā)展, 通過(guò)這種技術(shù), 不但可進(jìn)行定性檢測(cè), 還可進(jìn)行定量檢測(cè)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等許多優(yōu)點(diǎn), 但由于所需的試劑、儀器昂貴, 費(fèi)用高, 難以承擔(dān),欲將該技術(shù)真正運(yùn)用到常規(guī)檢驗(yàn)工作中存在相當(dāng)難度。
4、HIV 耐藥檢測(cè)
HIV 耐藥檢測(cè)的方法可分為基因型和表型2 大類檢測(cè)法。HIV 耐藥基因型檢測(cè)法基于對(duì)耐藥相關(guān)基因突變的檢測(cè), 利用耐藥基因型解釋系統(tǒng)判斷是否耐藥以及耐藥程度; HIV 耐藥表型檢測(cè)法基于體外培養(yǎng)技術(shù), 通過(guò)檢測(cè)抑制病毒生長(zhǎng)所需的藥物濃度( IC50 或IC90) , 并與參考株進(jìn)行比較, 判斷病毒對(duì)藥物的敏感程度。常用的HIV 耐藥檢測(cè)方法為基因型檢測(cè)法,通常使用逆轉(zhuǎn)錄PCR ( RT - PCR) 和測(cè)序方法。HIV 耐藥檢測(cè)用于HIV 感染人群和抗病毒治療人群的耐藥性監(jiān)測(cè)和檢測(cè)及個(gè)體患者的耐藥檢測(cè)。
5、CD4 + 和CD8 + T 淋巴細(xì)胞檢測(cè)
CD4 + 和CD8 + T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法分為2 大類, 一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定法, 另一類是非流式細(xì)胞儀測(cè)定法。常用的方法為流式細(xì)胞儀。通過(guò)CD4 + T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可評(píng)價(jià)HIV 感染者免疫狀況, 輔助臨床進(jìn)行疾病分期; 可作為兒童免疫抑制分級(jí)指標(biāo)及臨床治療分期和輔助條件; 可評(píng)估疾病進(jìn)展和HIV 感染者機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn); 可判斷預(yù)后狀況和輔助判斷是否進(jìn)行預(yù)防性治療; 可作為是否開始抗病毒治療和判斷免疫系統(tǒng)恢復(fù)情況的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之一。CD8 + T 淋巴細(xì)胞為抑制性/ 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞, HIV 感染者CD8 + T 細(xì)胞數(shù)量增加,導(dǎo)致CD4 /CD8 比值下降, 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo), CD4T 淋巴細(xì)胞/ CD8T淋巴細(xì)胞比值通常為2, 若該值小于1 則提示細(xì)胞免疫狀況不佳, 比值越低說(shuō)明免疫缺陷越嚴(yán)重。
6、HIV 的分離培養(yǎng)
一般采用靶細(xì)胞( HIV 陰性者外周血淋巴細(xì)胞, PBMC)與受檢者標(biāo)本( PBMC、全血、血漿、精液及其他體液) 共培養(yǎng)的方法, 最常用的方法是PBMC 共培養(yǎng)。樣本首選新鮮抗凝全血, 也可使用血漿、精液及其他體液, HIV 分離培養(yǎng)陽(yáng)性可確證為HIV 感染, 分離培養(yǎng)陰性不能排除HIV 感染。HIV 的分離培養(yǎng)可作為HIV 抗體不確定或HIV 陽(yáng)性母親所生嬰兒的鑒別診斷; 可用于HIV 表型耐藥檢測(cè)及其他HIV 生物學(xué)特征的研究; 還用于HIV 感染的輔助診斷。
7、HIV - 1 新近感染檢測(cè)
HIV 常規(guī)抗體檢測(cè)方法可判定感染和未感染狀態(tài), 新近感染檢測(cè)方法則用于識(shí)別近期感染與既往感染。目前, 檢測(cè)HIV新近感染的血清學(xué)方法中, 研究和應(yīng)用最多的是BED - EIA HIV - 1 捕獲EIA 方法( BED - CEIA) , 其原理是根據(jù)HIV 特異性IgG 占總IgG 抗體的比例隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高。應(yīng)用BED - CEIA 進(jìn)行新近感染檢測(cè)只適用于HIV 陽(yáng)性樣品。由于個(gè)體間抗體生成的變異性, 對(duì)個(gè)體而言, BED 結(jié)果的預(yù)測(cè)值偏低, 而且在個(gè)體水平上BED 檢測(cè)可能產(chǎn)生一定的假陽(yáng)性和假陰性, 但在人群水平上, 假陽(yáng)性的數(shù)目與假陰性的數(shù)目相近, 因此可相互抵消彼此的作用。美國(guó)FDA 將BED -CEIA 歸為“只應(yīng)用于監(jiān)測(cè)目的, 不能用于個(gè)體診斷和臨床”的實(shí)驗(yàn)方法。
以上介紹了艾滋病病毒各種檢測(cè)方法, 不同的方法有其優(yōu)缺點(diǎn), 臨床應(yīng)用也各異?？傊? 隨著感染者不斷增加、感染人群的變化和臨床病人的日益增多, 艾滋病檢測(cè)工作量逐漸加大, 新的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)需求也不斷增加, 這就要求廣大科研工作者在今后的工作中要有創(chuàng)新精神, 不斷探索, 研究開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑, 使其既能滿足艾滋病檢測(cè)工作的實(shí)際需要, 又能體現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展, 縮短檢測(cè)的窗口期, 避免漏檢, 以更有效地遏制艾滋病的蔓延, 保護(hù)廣大人民群眾的身體健康。
