( 二 ) 受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備
在哺乳動物的核移植研究中,用作核受體的主要有去核受精卵(原核胚 ) 及去核MⅡ成熟母細(xì)胞兩種。雖然采用去核受精卵的細(xì)胞質(zhì)作為核受體己得到了克隆動物,但供體胚胎不能超過2細(xì)胞階段,否則其重構(gòu)胚無法正常發(fā)育。成熟的卵母細(xì)胞被廣泛用作核移植的受體細(xì)胞。最初,受體卵母細(xì)胞大都采用超排體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞。隨著卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的完善,現(xiàn)在人們都采用體外成熟的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。此外,冷凍保存的卵母細(xì)胞指核移植受體細(xì)胞也是今后的發(fā)展方向。
受體卵母細(xì)胞在核移植前需進(jìn)行去核。如果不去核或去核不完全的話,將會因重組胚染 體的非整倍性和多倍體而導(dǎo)致發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。因此,去核方法極為重要,目前常用的去核方法有以下幾種。
1. 盲吸法
由于第一極體剛排出或排出后不久,染色體就在極體的附近,因此用顯微去核針吸取極體的部分細(xì)胞質(zhì)便可去掉細(xì)胞核。通常,采用盲吸法去核的時間應(yīng)盡可能選擇在剛排出第一極體時。
2."半卵法"
將卵母細(xì)胞切為兩半,去掉含有極體的一半,然后用不含極體的一半進(jìn)行核移植。雖然這種方法的去核率可保證100%,但由于細(xì)胞質(zhì)減半,會影響胚胎的正常發(fā)育,因此有人通過將兩枚去核的半卵與供體細(xì)胞融合,并取得了良好的效果。2001年,Booth 等將兩枚半卵與顆粒細(xì)胞融合,取得了90%的融合率和37%的囊胚發(fā)育率。
3. 熒光引導(dǎo)去核法
先用 Hoechst33342(2～8µg/ml)對卵母細(xì)胞染色10～15min,然后在熒光顯微鏡下確定核的位置,去核后再觀察吸去的細(xì)胞質(zhì)或去核后的卵母細(xì)胞是否含有細(xì)胞核,以保證去核成功率。