流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒（如微球、細(xì)菌、小型模式生物等）逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。作為應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)，現(xiàn)代流式細(xì)胞儀產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代。經(jīng)過(guò)近四十年的發(fā)展和完善，今天的流式細(xì)胞儀已經(jīng)十分成熟，并被廣泛的運(yùn)用于從基礎(chǔ)研究到臨床實(shí)踐的各個(gè)方面，涵蓋了細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域，在各學(xué)科中發(fā)揮著重要的作用。

概述

一種在液流系統(tǒng)中，快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)。其特點(diǎn)是通過(guò)快速測(cè)定庫(kù)爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞 DNA 含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開(kāi)，以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體。目前最高分選速度已達(dá)到每秒鐘三萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)綜合了流體力學(xué)技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)，是多學(xué)科多領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的結(jié)晶。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，為了滿足生命科學(xué)對(duì)細(xì)胞分析更高層次的要求，流式細(xì)胞技術(shù)仍然在快速發(fā)展，并已經(jīng)在檢測(cè)技術(shù)、分選技術(shù)及高通量分析等方面取得了許多突破。

簡(jiǎn)史

1934 年 A.莫爾達(dá)萬(wàn)首次報(bào)道了使懸浮的紅細(xì)胞通過(guò)放置在顯微鏡載物臺(tái)上的玻璃毛細(xì)管的細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)方法。1956 年 W.H.庫(kù)爾特介紹一種利用細(xì)胞在導(dǎo)電溶液中, 通過(guò)兩個(gè)小室間小孔（75～100 微米）時(shí)的電阻變化（稱為庫(kù)爾特電阻）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和測(cè)定細(xì)胞體積的裝置。1965 年 L.A.卡門茨基制成了多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)，可測(cè)定細(xì)胞大小和核酸含量。同年，M.J.富爾懷勒又制成細(xì)胞分選器。1969 年范迪拉等應(yīng)用氬離子激光器和分層殼流技術(shù)，建立了一臺(tái)液流、照明光軸和檢測(cè)器軸互相正交的流式細(xì)胞計(jì)。

以后，經(jīng) H.R.休利特等改進(jìn)了的細(xì)胞分選計(jì)，能使流動(dòng)液體內(nèi)的細(xì)胞噴射到空氣中進(jìn)行測(cè)量。但上述各系統(tǒng)中，所使用的激光光束以及設(shè)在收集熒光的檢測(cè)方向上的限制光欄都比液流中的細(xì)胞大，因而不能提供關(guān)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的信息，故稱為零分辨率系統(tǒng)。隨后，L.L.惠利斯和 S.F.帕滕發(fā)展了一種低分辨率的狹縫掃描技術(shù)，可以測(cè)定細(xì)胞核熒光、細(xì)胞和細(xì)胞核的大小。1969 年，W.格德和 W.迪特里希描述了使用汞燈做光源的流式細(xì)胞光度計(jì)，在落射光照明下，可激發(fā)在流動(dòng)室中與光軸平行流動(dòng)的細(xì)胞。

原理

待測(cè)樣品（如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等）經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過(guò)殼液包圍的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動(dòng)室，排成單列的細(xì)胞，由流動(dòng)室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長(zhǎng)。熒光檢測(cè)器為光電倍增管。散射光檢測(cè)器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。

整個(gè)儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號(hào)和光散射信號(hào)。測(cè)定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來(lái)表示。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動(dòng)室發(fā)生振動(dòng)，把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細(xì)胞。這些細(xì)胞在形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定了它們的信號(hào)（代表細(xì)胞的性質(zhì)），如果測(cè)得信號(hào)與所選定的要進(jìn)行分選的細(xì)胞性質(zhì)符合，或者說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)了要進(jìn)行分選的細(xì)胞時(shí)則在這個(gè)選定細(xì)胞剛形成液滴時(shí)，儀器給整個(gè)液流充以短暫的正或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開(kāi)液流后，其中被選定細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細(xì)胞液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生向陰極或向陽(yáng)極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。

應(yīng)用

細(xì)胞生物學(xué)研究

流式細(xì)胞術(shù)可用于測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分比。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞群體中每個(gè)細(xì)胞的 DNA 含量，得出 DNA 含量分布曲線。例如，在測(cè)定 Hela 細(xì)胞 DNA 含量分布曲線上，第一個(gè)峰是含有 2CDNA 含量的 G1/G0（DNA 合成前期/靜止期）細(xì)胞, 其次一個(gè)峰是 4CDNA 含量的 G2+M（DNA 合成后期＋有絲分裂期） 細(xì)胞，從 2C～4C 間的區(qū)域?yàn)?S 期（DNA 合成期）細(xì)胞。采用繪圖法或計(jì)算機(jī)擬合法可計(jì)算出細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞群體的百分?jǐn)?shù)。

?用流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行多參數(shù)分析，即同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。例如細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，DNA 發(fā)綠色熒光，RNA 發(fā)紅色熒光。測(cè)定這兩種熒光就能同時(shí)得知一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的 DNA 和 RNA 含量。測(cè)定結(jié)果可用二維散點(diǎn)圖或三維立體圖表示。用這種方法可根據(jù) DNA 和 RNA 含量而鑒別出 G0 與 G1、M 期和 G2 期細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)與液體閃爍技術(shù)相配合, 還可求得細(xì)胞通過(guò) G1、S 和 G2+M 期的時(shí)間 （T、Ts、T+M） 及其變異系數(shù)。

近年利用抗溴脫氧尿苷（Brdurd）單克隆抗體能發(fā)現(xiàn)滲入到細(xì)胞 DNA 內(nèi)的溴脫氧尿苷。將此種熒光抗體技術(shù)與測(cè)定細(xì)胞 DNA 含量相結(jié)合，是研究 DNA 合成和細(xì)胞周期的一種非常有用的技術(shù)。此外, 流式細(xì)胞術(shù)還可測(cè)定細(xì)胞群體同步化的程度和所處的時(shí)期，鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，利用熒光標(biāo)記配體，還可定量測(cè)定細(xì)胞表面和內(nèi)部的受體等。

遺傳學(xué)研究

用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定染色體 DNA 含量, 可得到染色體頻率分布圖（圖 2），稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個(gè)峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體, 做成人類每條染色體的 DNA 文庫(kù)，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

免疫學(xué)研究

結(jié)合免疫熒光方法，流式細(xì)胞術(shù)可辨認(rèn)和計(jì)數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細(xì)胞，例如用熒光素標(biāo)記的免疫球蛋白鑒別 T 和 B 淋巴細(xì)胞（圖 3），根據(jù)細(xì)胞表面抗原的不同, 進(jìn)一步分辨出不同的 T 和 B 淋巴細(xì)胞亞群，以及測(cè)定每個(gè)細(xì)胞所帶抗原的數(shù)量、密度及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。也可用流式細(xì)胞分選技術(shù)將帶有「＋」和不帶有「－」的某種特異抗原的細(xì)胞群體分類收集，供研究其功能特性。

流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于判斷免疫缺陷癥，如愛(ài)滋?。ǐ@得性免疫缺損綜合征）的重要特征，即 T4 和 T8 淋巴細(xì)胞比例改變（T4 細(xì)胞大量減少）以及判斷自身免疫病和確定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細(xì)胞上的熒光素標(biāo)記的外源凝集素，測(cè)定細(xì)胞表面積和熒光素結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)密度，結(jié)合細(xì)胞動(dòng)力學(xué)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細(xì)胞表面結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性等。

腫瘤學(xué)研究

腫瘤細(xì)胞一般都含有異常數(shù)量的 DNA。在大多數(shù)實(shí)體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細(xì)胞，由于流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān) DNA 倍性的信息, 因而能提供有價(jià)值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測(cè)量 DNA 含量的同時(shí)，再測(cè)定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞大小、核質(zhì)比等）則可進(jìn)一步提高診斷的可靠性。

流式細(xì)胞術(shù)可在實(shí)驗(yàn)和臨床中評(píng)價(jià)腫瘤化療和放療的作用，現(xiàn)在根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)監(jiān)視腫瘤治療的工作已經(jīng)在實(shí)際工作中開(kāi)展起來(lái)。

此外，流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中也得到廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)正在向高靈敏、高速度、多參數(shù)測(cè)量、獲取形態(tài)學(xué)信息等方面發(fā)展。