細(xì)胞培養(yǎng)

首先，抗生素的發(fā)展使得我們可以輕易避免許多曾經(jīng)困擾細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題。第二是技術(shù)的發(fā)展，如利用胰酶將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來(lái)，從而獲得持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞株(如HeLa細(xì)胞)。第三，利用這些細(xì)胞株，科學(xué)家們能夠研制標(biāo)準(zhǔn)化、化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)而更利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。這三個(gè)方面的聯(lián)合發(fā)展，使得越來(lái)越多的科學(xué)家在他們的研究中采用了細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)的方法。

在上個(gè)世紀(jì)60年代和70年代，這一技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用更進(jìn)一步影響細(xì)胞的培養(yǎng)且一直持續(xù)到今天。如康寧公司開(kāi)始研發(fā)和銷售一次性塑料和玻璃細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品、改進(jìn)的過(guò)濾產(chǎn)品和材料、液體和粉末狀組織培養(yǎng)基以及高通量藥物篩選的系列相關(guān)產(chǎn)品。這些和其他技術(shù)的持續(xù)發(fā)展使得細(xì)胞培養(yǎng)在大量實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)企業(yè)中的應(yīng)用更為普遍。

在150mm培養(yǎng)皿表面對(duì)人包皮外植體進(jìn)行固定染色。培養(yǎng)外植體大約兩個(gè)星期。9個(gè)外植體中2個(gè)無(wú)法生長(zhǎng)。剩下的外植體生長(zhǎng)良好。每個(gè)方框約寬2cm。

原代培養(yǎng)

當(dāng)采用外科操作的方法將細(xì)胞從有機(jī)體中分離下來(lái)，然后置于合適的培養(yǎng)環(huán)境中，它們會(huì)附著、分裂和生長(zhǎng)。這稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)有兩種基本的方法。第一種，使用外植塊，將小片的組織粘附到玻璃或經(jīng)處理的塑料培養(yǎng)瓶中，并浸于培養(yǎng)液中。幾天之后，單個(gè)細(xì)胞將從組織外植塊中移動(dòng)到培養(yǎng)瓶的表面或基質(zhì)中開(kāi)始分裂生長(zhǎng)。第二種方法，也是使用更廣泛的方法，通過(guò)在組織碎片中加入消化（蛋白水解）酶，如胰酶或膠原酶，消化成團(tuán)聚集的細(xì)胞從而加快這一步驟。最終得到單細(xì)胞的懸液，然后將其置于含有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，讓其繼續(xù)生長(zhǎng)分裂。這種方法成為酶解。

對(duì)亮星花魚(yú)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。胚胎切碎后用胰酶進(jìn)行解離。然后將細(xì)胞培養(yǎng)一周左右，形成融合的單層細(xì)胞。

傳代接種

當(dāng)原代培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)且布滿了所有可用的培養(yǎng)基質(zhì)后，它們必須進(jìn)行傳代以便為繼續(xù)生長(zhǎng)提供空間。這通常需要將細(xì)胞盡可能輕柔地從基質(zhì)上用胰酶消化下來(lái)。這些酶類似于原代培養(yǎng)中使用的酶，它能夠打斷使細(xì)胞粘附到基質(zhì)上的蛋白鍵。有些細(xì)胞株可以通過(guò)輕輕刮除培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞加以收集。收集之后，將細(xì)胞懸液進(jìn)行進(jìn)一步的分散并置于新的培養(yǎng)瓶中。

當(dāng)細(xì)胞過(guò)多時(shí)，則可以用合適的低溫保護(hù)的試劑，如二甲基亞砜或甘油進(jìn)行小心冰凍，然后置于低溫環(huán)境（－130℃以下）中，直到需要再次使用。低溫保存細(xì)胞的理論和技術(shù)已經(jīng)包括在康寧技術(shù)通報(bào)：關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)低溫保存的初級(jí)指南（參考文獻(xiàn)9）。