細胞在培養(yǎng)過程中容易受到支原體的污染，往往對實驗產(chǎn)生非常不好的影響，發(fā)現(xiàn)的早則耽誤些功夫重新培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)的晚可能一段時間內(nèi)的實驗都白做了，那么如何通過不同的檢測方法檢測到支原體的蹤跡？

　　支原體是非常微小的微生物，其直徑只有0.2-0.8µm，是細胞培養(yǎng)中令人頭疼的大問題。關(guān)鍵是其污染源簡直來自四面八方：

• 培養(yǎng)基

• 血清

• 實驗操作者

• ．．．

會影響：

• 細胞生長率

• 細胞形態(tài)

• 基因表達

• 細胞代謝和細胞活力。

　　支原體感染不易察覺，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測就非常重要。

　　污染實驗室培養(yǎng)細胞的支原體主要有八種，但還沒有哪種檢測方法能夠單槍匹馬把這八種支原體都檢測出來。支原體非常頑強，通常用于細胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細菌細胞壁，但支原體沒有細胞壁因此就不受影響。

　　無懈可擊的細胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預防支原體感染的最佳方式，另外及時找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在感染擴散前快速采取有效措施。刀王就為你介紹幾種在培養(yǎng)細胞中檢測支原體的常用方法。

分離培養(yǎng)法

　　分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標方法，其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上瘋狂生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽為支原體檢測金標準。

　　不過分離培養(yǎng)法也存在兩個弊端：

　　一是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間；

　　二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候，例如支原體M.hyorhinis。

　　如果你實在不想等這么久，或者希望在分離培養(yǎng)法的等待過程中先拿到初步結(jié)果，你可以試一試DNA、PCR或酶學檢測方法。不過需要注意的是，上述檢測方法都不能單獨檢出所有類型的支原體，而且靈敏度也沒有分離培養(yǎng)法高，所以最好結(jié)合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測結(jié)果。

DNA檢測

　　DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天時間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時，就可以在指示細胞的核周圍觀察到熒光斑點或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來檢測支原體M.hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準確的將其檢測出來。

PCR法

　　PCR法也可以檢測M.hyorhinis菌株，PCR法檢測支原體只需幾個小時，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測大多數(shù)支原體，但謹慎起見最好同時使用另一種檢測方法來進行驗證。

酶學檢測和ELISA

　　此外，也還存在一些其他支原體檢測方法。例如酶學檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。ELISA也能用于支原體檢測，以ELISA法為基礎的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。

定期檢測

　　支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細胞培養(yǎng)實驗室應對支原體感染的關(guān)鍵。

預防支原體污染的建議：

細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：

• 控制環(huán)境污染;

• 嚴格實驗操作;

• 細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌;

• 在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。

　　支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有

• 抗生素處理

• 抗血清處理

• 抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理

　　支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細胞，不會重新感染支原體。

　　支原體污染在細胞培養(yǎng)中實際上是比較常見的， 據(jù)資料，可達30%甚至更高。支原體污染時細胞表現(xiàn)為長得不好，也不死亡，同時，培養(yǎng)基又是清亮的。時間長達一周也沒有什么變化。這時基本上可以判斷出是支原體污染了，愿意檢測就檢測一下，不愿意直接用清除試劑處理吧。

　　避免細胞污染，可以從預防著手，超凈工作臺物品放置要合理、進入細胞房要換鞋和穿實驗服、實驗員戴手套后要用酒精等消毒、避免細胞交叉污染等等。