細(xì)胞轉(zhuǎn)染是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的一種常用的技術(shù)手段。而轉(zhuǎn)染效率低下卻是實(shí)驗(yàn)狗們經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，更是因?yàn)殡y度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應(yīng)該是談原代細(xì)胞色變。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的protocol教科書和實(shí)驗(yàn)手冊上面都有，毛博不想再重復(fù)了。這里，毛博根據(jù)自己做細(xì)胞轉(zhuǎn)染近10年的經(jīng)驗(yàn)和體會，總結(jié)出了導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下的八個大坑，以及避免掉坑里的一些做法。都是干貨喲。

1.準(zhǔn)備不足

做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實(shí)驗(yàn)前要多做預(yù)試驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等。

2.電壓過大

做電轉(zhuǎn)的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。不同的細(xì)胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實(shí)驗(yàn)，多摸索條件。對于大多數(shù)細(xì)胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是最強(qiáng)的。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x10⁶到1x10⁷／mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉(zhuǎn)染效率也大大降低。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)損傷。

3.試劑過期

有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。最后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine 2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，盡量使用開封半年內(nèi)的Lipofectamine 2000，因?yàn)檫^了半年后，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性大大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻大大下降。千萬不要為了省錢，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。

4.未加血清

轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn)，其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長。那么，什么是最佳時機(jī)呢？在20%的細(xì)胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機(jī)。

5. 細(xì)胞污染

細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。毛博這里再貢獻(xiàn)一個獨(dú)門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。

6.質(zhì)粒不行

轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候，就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。

7.不注意細(xì)節(jié)

在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié)，但是，如果不注意的話，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。

8.細(xì)胞狀態(tài)不好

細(xì)胞狀態(tài)不好，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細(xì)胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話，應(yīng)該是6X105個/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前一天換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次。轉(zhuǎn)染的整個過程都不應(yīng)該有抗生素。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是個細(xì)活。稍微不小心，就會掉坑里。以上，毛博介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的實(shí)驗(yàn)狗們能夠避免這些毛博當(dāng)年踩過的大坑，早日出成果，早日出文章。