細(xì)胞在培養(yǎng)過程中容易被污染,很多養(yǎng)細(xì)胞的朋友在這方面困惑頗多,今天針對(duì)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞談?wù)劇?在討論之前,大家首先要有一個(gè)概念,即潔凈區(qū),并不是沒有細(xì)菌,而是細(xì)菌的數(shù)量非常少,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)100級(jí)的潔凈標(biāo)準(zhǔn)是浮游菌數(shù)不得超過5個(gè)每立方米,沉降菌數(shù)不得超過1個(gè)每培養(yǎng)皿,而國(guó)外的標(biāo)準(zhǔn)比我國(guó)的還要高一點(diǎn),要求的數(shù)量更少。 所以在我們的潔凈操作臺(tái)里,并不是真正一個(gè)細(xì)菌都沒有的,所以在操作的時(shí)候還是要盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進(jìn)入培養(yǎng)體系細(xì)菌的數(shù)量。 所以處理細(xì)菌污染的重要原則就是:無限地稀釋細(xì)菌的濃度,無限地減少細(xì)菌的數(shù)量!
污染處理流程
1、將污染的培養(yǎng)液倒掉,轉(zhuǎn)燒瓶口,加入10 mlPBS,適當(dāng)晃動(dòng)清洗培養(yǎng)瓶,然后倒掉。轉(zhuǎn)燒瓶口。
2、繼續(xù)加入10mlPBS,同樣方法晃動(dòng),清洗培養(yǎng)瓶,然后倒掉。
3、繼續(xù)加入5mlPBS,同樣方法洗瓶,主要是培養(yǎng)面,然后倒掉。
4、重復(fù)步驟3再洗。
5、重復(fù)步驟3再洗。
6、加入3-5ml雙抗,洗瓶,靜置3-5分鐘,然后吸出。
7、加入3ml雙抗,洗瓶,靜置3-5分鐘,然后吸出。
8、再加入5mlPBS洗瓶,然后吸出。
9、加入10ml培養(yǎng)液,加入2ml雙抗,放置培養(yǎng)箱培養(yǎng),5小時(shí)之后,倒掉培養(yǎng)基,加入PBS洗瓶?jī)纱?,然后加入胰酶消化,吹打后置于離心機(jī)800-1000r/min離心,然后洗一次。置于新的培養(yǎng)瓶里培養(yǎng),培養(yǎng)體系加入2ml雙抗。
10、24h之后,視情況換液,若仍然污染嚴(yán)重,培養(yǎng)基渾濁,重復(fù)以上步驟,若看不到污染物,則繼續(xù)步驟1)、3)、4)、6)、8),然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)體系加入2ml雙抗。
11、24h之后,若仍污染嚴(yán)重,可再重復(fù)一次,若還污染只能棄之(不過一般沒有出現(xiàn)這種情況),若鏡下不見污染物,則換液PBS洗瓶,正常培養(yǎng)。
以上是對(duì)于細(xì)菌污染(常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌);若為霉菌或者真菌污染,加入兩性霉素B清洗和培養(yǎng),終濃度一般為2.5μg/ml(在30μg/ml時(shí)會(huì)有細(xì)胞毒性)。另外也可以選擇在培養(yǎng)基里加3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。 其它操作同;若為支原體,用泰樂處理支原體污染效果比較好;若為黑膠蟲污染,我基本上重新培養(yǎng)了,除此還是需要你在無菌觀念和無菌操作上下大功夫加強(qiáng)了,黑膠蟲在科研領(lǐng)域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應(yīng)對(duì)方法。預(yù)防為主,還是要強(qiáng)調(diào)無菌操作,尤其注意血清的質(zhì)量,這個(gè)是主要來源。一般建議用北美血清,這個(gè)黑膠蟲污染會(huì)概率小。
在操作的過程中,一定要小心操作動(dòng)作,輕柔緩慢,切忌大動(dòng)作魯莽。防止細(xì)胞脫落。以上方法操作得當(dāng),基本上都能救活你的細(xì)胞(我還沒有聽到?jīng)]救活的反饋)。當(dāng)然如果你的細(xì)胞仍有富余或者凍存的,我還是建議你把污染的扔掉,再復(fù)蘇方便省事。這個(gè)拯救細(xì)胞還是主要針對(duì)你就只剩這一瓶細(xì)胞無路可退的時(shí)候。