MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
一、實(shí)驗(yàn)原理
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快捷。
二、主要材料
· 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基
· 胰蛋白酶
· 胎牛血清
· PBS
· 青霉素-鏈霉素溶液（100X）
· MTT試劑
· DMSO
三、主要試劑配制
細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液：-20℃保存，臨用前按體積比配成含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)液。
抗菌素溶液：青霉素-鏈霉素溶液（100X）加入培養(yǎng)基中100倍稀釋。
PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑用ddH2O定容至1000 ml，調(diào)pH7.2，121℃、30min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
5mg/ml MTT溶液：稱取MTT 0.5g，溶于100 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）或無酚紅培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃避光保存即可。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1.取經(jīng)不同處理的細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml。
2.分別接種于96孔板中，每孔100 μl，每組細(xì)胞設(shè)3~5個(gè)復(fù)孔
3.將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)到適當(dāng)時(shí)間
4.每孔加入10μl 5mg/ml MTT溶液（注意不能產(chǎn)生氣泡），在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4~6h。
5. 4~6h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6.每孔加入150ul DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490nm處各孔吸光度值。
7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對(duì)照孔（未經(jīng)處理的細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
