1．用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長達(dá)到60%-70%，吸出舊培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理，繼續(xù)培養(yǎng)。

2．根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。（注意：懸浮細(xì)胞不需要胰酶消化，直接收集到離心管即可）

3．加入步驟（2）中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟（2）中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

4．取5-10萬重懸的細(xì)胞，200g離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。

5．加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。

6．室溫(20-25℃)避光孵育10 min。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。

7．200g離心5 min，棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。

8．加入10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。

9．進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

注意：FITC為綠色熒光，此檢測(cè)方法不適用于已帶綠色熒光標(biāo)簽的細(xì)胞

二、結(jié)果示例及分析

四個(gè)象限的意義

左上/P2-Q1：壞死細(xì)胞；

右上/P2-Q2：晚期凋亡細(xì)胞；

右下/P2-Q3：早期凋亡；

左下/P2-Q4：未發(fā)生凋亡的細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡率：P2-Q2與P2-Q3象限百分率的和。