在細(xì)胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細(xì)胞生活狀態(tài)和鑒別細(xì)胞死活，確定細(xì)胞接種濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細(xì)胞懸液中細(xì)胞活力的鑒別，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活力檢測(cè)等。細(xì)胞懸液制備后，常用活體染料臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)不能透過(guò)活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色。而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）。細(xì)胞計(jì)數(shù)一般用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，便于確定細(xì)胞的生活狀況。

一、所需物品

0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液

無(wú)水乙醇或95％乙醇溶液

脫脂棉

相差顯微鏡

試管、吸管、毛細(xì)吸管

細(xì)胞計(jì)數(shù)板

二、方法

1. 將動(dòng)物細(xì)胞用PBS制備成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液備用。

2. 用無(wú)水乙醇或95％乙醇溶液擦拭計(jì)數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計(jì)數(shù)板上面。

3. 用滴管吸取0.4％臺(tái)盼藍(lán)染液，按1∶1比例加入細(xì)胞懸液中。從計(jì)數(shù)板邊緣緩緩滴入，使之充滿(mǎn)計(jì)數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計(jì)數(shù)板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計(jì)數(shù)。

4. 按圖計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格（每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在一個(gè)大方格中，如果有細(xì)胞位于線(xiàn)上，一般計(jì)下線(xiàn)細(xì)胞不計(jì)上線(xiàn)細(xì)胞，計(jì)左線(xiàn)細(xì)胞不計(jì)右線(xiàn)細(xì)胞。二次重復(fù)計(jì)數(shù)誤差不應(yīng)超過(guò)±5％。鏡下觀察，凡折光性強(qiáng)而不著色者為活細(xì)胞，染上藍(lán)色者為死細(xì)胞。

5. 計(jì)完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0.01cm2，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1ml＝1000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10,000＝細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計(jì)算：

細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml＝4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10,000

6. 如計(jì)數(shù)前已稀釋?zhuān)稍俪讼♂尡稊?shù)。

7. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞懸液濃度并求出存活與死亡細(xì)胞數(shù)的比例。

三、注意事項(xiàng)

1. 向計(jì)數(shù)板中滴細(xì)胞懸液時(shí)要干凈利落，加量要適當(dāng)，過(guò)多易使蓋片漂移，或淹過(guò)蓋片則失敗，需重做；過(guò)少易出現(xiàn)氣泡；不理想時(shí)，應(yīng)重做；

2. 鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，若方格中細(xì)胞分布明顯不均，說(shuō)明細(xì)胞懸液混合不均勻，需重新將細(xì)胞懸液進(jìn)行混合，再重新計(jì)數(shù)。

3. 計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)于位于邊線(xiàn)或交界處的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)，遵循“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的規(guī)則；

4. 一個(gè)細(xì)胞團(tuán)計(jì)做一個(gè)細(xì)胞。